2022年10月27日，北京大學藥學院化學生物學系和天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室王晶研究員課題組聯(lián)合北京大學生命科學學院伊成器教授課題組，在國際頂級學術期刊Nature Biotechnology發(fā)表題為“Absolute quantification of single-base m⁶A methylation in the mammalian transcriptome using GLORI”的研究成果。

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m⁶A是高等真核生物mRNA內(nèi)部含量最豐富的修飾，0.2-0.6%的腺苷中存在m⁶A修飾。m⁶A依賴修飾酶、去修飾酶和結合蛋白發(fā)揮調(diào)控功能。目前已發(fā)現(xiàn)m⁶A具有調(diào)控mRNA剪接、出核、穩(wěn)定性和蛋白翻譯等功能，可以參與發(fā)育、配子發(fā)生、細胞重編程、生物節(jié)律、疾病等多種生理和病理過程的功能調(diào)控。為了更好地研究m⁶A生物功能和臨床病理研究，開發(fā)m⁶A高通量測序技術一直是m⁶A領域的熱點。

盡管當下已經(jīng)開發(fā)了多種m⁶A檢測和測序方法，但是現(xiàn)有的技術仍然存在幾個重要的局限性：（1）基于m⁶A抗體的檢測方法無法獲得其高分辨率的位點信息；（2）基于限制性內(nèi)切酶的檢測技術只能檢測含有ACA 基序的m⁶A；（3）基于三代測序和機器學習的方法。盡管這種方法能夠提供m⁶A的單堿基信息且能夠進行定量，但是三代測序存在價格昂貴、檢測準確性低等問題，且不能夠?qū)崿F(xiàn)對m⁶A的絕對定量。迄今為止，對m⁶A全轉錄組的無偏好檢測和絕對定量仍未得到解決。

王晶課題組開發(fā)的m⁶A檢測技術“GLORI”（Glyoxal and nitrite-mediated deamination of unmethylated adenosine）突破了以上技術的局限性，首次實現(xiàn)了真正意義的高效率、高靈敏度、高特異性、無偏好單堿基m⁶A位點檢測，并對m⁶A位點的修飾水平進行絕對定量。GLORI的技術核心是不依賴于抗體，通過化學反應組合篩選發(fā)現(xiàn)乙二醛和亞硝酸鹽的催化體系，對未甲基化的腺苷進行高效的脫氨從而形成肌苷（A-to-I，> 98%），肌苷在測序過程中被讀成鳥苷(G)，形成A-to-G的轉化；而m⁶A測序后仍被讀成A，從而實現(xiàn)對m⁶A的單堿基識別。GLORI通過檢測測序的讀段序列中A所占的比例，實現(xiàn)了對單堿基m⁶A的絕對定量。因此，GLORI技術在概念上類似于利用亞硫酸氫鹽定量分析基因組5mC的方法。

GLORI 的檢測原理。a. GLORI實現(xiàn)A-to-I的轉化；b.GLORI的化學反應過程；c.GLORI中乙二醛和亞硝酸鹽介導脫氨作用前后（上）和（下）的LC-MS/MS分析；d. GLORI技術在基因MRPS26上定量檢測m⁶A位點的例子

王晶課題組與伊成器課題組合作，在HEK293T轉錄組中鑒定出176,642個m⁶A位點，并且發(fā)現(xiàn)隨著測序深度的增加，可檢測的m⁶A位點仍未飽和，該結果擴展了人們對mRNA上m⁶A存在數(shù)量的認識。此外，GLORI技術能夠?qū)崿F(xiàn)對m⁶A的準確定量：即使修飾水平較低的m⁶A（5%），GLORI也能夠?qū)崿F(xiàn)準確檢測。對含有不同m⁶A修飾水平的mRNA進行進一步功能分析后發(fā)現(xiàn)，mRNA上整體m⁶A的修飾水平和RNA的轉錄水平及翻譯效率都呈現(xiàn)負相關。至此，研究團隊利用GLORI技術首次實現(xiàn)了全轉錄組的m⁶A定量圖譜，也完成了對基因表達和翻譯調(diào)控的定量評估。

GLORI轉錄組內(nèi)定量檢測m⁶A。a.GLORI在HEK293中檢測的位點；b.GLORI能夠準確檢測spike-in中m⁶A位點的修飾水平；c.GLORI檢測的m⁶A位點的修飾水平在技術重復之間的相關性；d.HEK293中m⁶A位點修飾水平的整體分布；e.含有不同m⁶A修飾水平的mRNA的轉錄水平；f.含有不同m⁶A修飾水平的mRNA的翻譯效率比較

此外，王晶課題組還發(fā)現(xiàn)在一些基因的特定區(qū)域中出現(xiàn)了一類聚集分布的m⁶A位點（m⁶A簇）。相比于不具有這類m⁶A簇的基因，這類m⁶A簇的基因顯著降低基因的轉錄水平和翻譯效率，從而發(fā)揮負調(diào)控基因的表達作用。

m⁶A簇的發(fā)現(xiàn)與功能。a.SPEN基因的特定區(qū)域有聚集分布的m⁶A簇；b.參與形成m⁶A簇的m⁶A位點具有顯著高的修飾水平；c.具有m⁶A簇的mRNA具有顯著低的轉錄水平；d.具有m⁶A簇的mRNA具有顯著低的翻譯效率

王晶課題組將GLORI技術應用于HeLa及MEF兩種細胞系中存在熱休克及缺氧的兩種壓力條件下，進一步觀察m⁶A的動態(tài)調(diào)控并提供了轉錄組上m⁶A對壓力條件應激的定量圖譜。結果表明，在兩種壓力體系下有4.8-11%m⁶A位點具有動態(tài)變化，并且上調(diào)和下調(diào)的m⁶A位點表現(xiàn)出不同的富集模式：在缺氧時，上調(diào)和下調(diào)的m⁶A位點主要富集在5′UTR和終止密碼子附近，而熱休克體系中這種富集則呈現(xiàn)相反的結果。不同于野生型細胞中m⁶A對基因表達的負調(diào)控作用：在熱休克條件下，m⁶A整體修飾水平升高的mRNA的翻譯效率顯著上調(diào)，且這種上調(diào)的調(diào)控作用在具有m⁶A簇的mRNA中更為顯著。該結果提示了m⁶A在不同環(huán)境下對基因表達中具有特異性的調(diào)控，也為后續(xù)研究m⁶A動態(tài)調(diào)控的生物學功能提供了有力的技術工具。

GLORI檢測動態(tài)變化的m⁶A。a.缺氧誘導m⁶A位點的mRNA分布圖譜；b.熱休克誘導m⁶A位點的mRNA分布圖譜；c.熱休克前后MEF細胞中上調(diào)m⁶A相關基因翻譯效率的箱線圖和點圖；d.熱休克后具有或不具有m⁶A簇的基因的翻譯效率的箱線圖

綜上，該研究展示了GLORI技術高靈敏度、高特異性的無偏好單堿基絕對定量檢測m⁶A的特性，攻克了當下m⁶A定量測序技術的瓶頸?；谄湓跈z測m⁶A方面的優(yōu)異表現(xiàn)，GLORI將有助于推動和解決m⁶A在細胞分化、胚胎發(fā)育和臨床檢測等多種領域中的功能研究和核心生物學問題，有望成為定量m⁶A測序技術的“金標準”。

衣云鵬

申衛(wèi)國

王晶、伊成器為本研究論文的通訊作者。北京大學藥學院2018年博士后衣云鵬（已出站）、2018級直博生申衛(wèi)國，以及北京大學生命科學學院博士后劉聰，博士生孫含笑、李楷（已畢業(yè)）為論文的共同第一作者。該工作得到科技部重點研發(fā)計劃和國家自然科學基金委等項目資助。

來源：北京大學