CIRSPR/Cas9是一種在單條guide RNA（gRNA）的指導(dǎo)下利用Cas9核酸酶對靶標(biāo)DNA進(jìn)行特異性識別和切割的技術(shù)。該過程涉及到Cas9/gRNA與雙鏈DNA（dsDNA）非特異性的結(jié)合、在dsDNA上搜索并識別PAM位點、通過與PAM上游的同源匹配形成RNA/DNA異源雙鏈從而實現(xiàn)在dsDNA上靶點區(qū)域的特異性結(jié)合和切割。由于Cas9可以高效快捷地靶向并切割dsDNA，因而被廣泛地應(yīng)用于基因編輯、基因表達(dá)調(diào)控、基因定位和成像等領(lǐng)域。但是，Cas9如何在大量DNA中快速定位其靶標(biāo)尚不清楚。盡管有研究報道了Cas9在低鹽濃度下利用三維和一維擴(kuò)散模式搜索靶點，但缺乏闡釋其在生理鹽濃度下靶標(biāo)搜尋這一動態(tài)過程的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)和分子定量模型。
科研成果 | 陳春來、劉俊杰課題組合作揭示spCas9蛋白搜索靶點的分子機(jī)制模型-肽度TIMEDOO
圖1.spCas9蛋白搜索靶標(biāo)DNA的分子機(jī)制模型
2021年8月20日，北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心陳春來和結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心劉俊杰課題組合作在《化學(xué)科學(xué)》（Chemical Science）雜志發(fā)表了題目為“spCas9與PAM下游DNA位點的非特異性相互作用加速其靶點搜索過程（Nonspecific interactions between SpCas9 and dsDNA sites located downstream of the PAM mediate facilitated diffusion to accelerate target search）” 的研究論文。該論文揭示了在生理鹽濃度下，spCas9利用三維和一維擴(kuò)散實現(xiàn)高效搜索靶點，其1151-1156位的賴氨酸殘基與PAM下游 ~ 8 bp DNA位點的非特異性結(jié)合是介導(dǎo)一維擴(kuò)散并造成PAM側(cè)翼不對稱一維搜索的主要原因。該文揭示了spCas9在生理鹽濃度下的獨特搜索靶點機(jī)制和相應(yīng)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)，為Cas9體內(nèi)和體外的應(yīng)用提供了重要指導(dǎo)。

結(jié)合生化實驗與單分子熒光技術(shù)，該研究發(fā)現(xiàn)，在生理鹽濃度下，spCas9利用三維和一維擴(kuò)散實現(xiàn)快速搜尋靶點。spCas9的一維擴(kuò)散以PAM位點為中心展現(xiàn)出了不對稱的搜索區(qū)域（從PAM上游 ~ 10 bp到PAM下游 ~ 30 bp），將靶標(biāo)搜索效率提高了10倍以上。同時，結(jié)合Cas9/gRNA/DNA二聚體的單顆粒冷凍電鏡結(jié)構(gòu)和單分子熒光實驗進(jìn)一步揭示，PAM下游的~ 8 bp DNA位點與Cas9的1151-1156位賴氨酸殘基（尤其是1153位賴氨酸）之間的存在緊密的非特異性相互作用，是介導(dǎo)Cas9一維擴(kuò)散并導(dǎo)致PAM側(cè)翼的不對稱搜索區(qū)域的主要原因。而通過改變Cas9與DNA的相互作用，包括突變1151-1156位賴氨酸殘基、降低緩沖體系的鹽濃度以及改變PAM識別殘基，都會影響其一維擴(kuò)散的過程。

最后，該研究提出了spCas9搜索靶點的詳細(xì)分子模型（圖1）：在生理鹽濃度下，溶液中自由擴(kuò)散的Cas9/gRNA復(fù)合物通過三維隨機(jī)碰撞與dsDNA相互作用。一旦通過1151-1156位賴氨酸殘基與dsDNA非特異性相互作用，spCas9就會瞬時結(jié)合并沿dsDNA雙螺旋進(jìn)行~ 20 bp的一維擴(kuò)散以尋找PAM位點。一旦搜索到同源靶標(biāo)就會結(jié)合形成復(fù)合物，否則會被釋放進(jìn)入溶液并重新進(jìn)入搜索過程。spCas9通過與PAM下游區(qū)域的非特異性結(jié)合使靶標(biāo)搜索速率提高了10倍以上，該研究為spCas9 的靶標(biāo)位點設(shè)計提供了重要指導(dǎo)。

北京市生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心陳春來研究員與結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心劉俊杰研究員為本文共同通訊作者。清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院CLS項目已畢業(yè)博士生楊夢銥（現(xiàn)為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院營養(yǎng)與發(fā)育研究室研究實習(xí)員）為本文第一作者。生命學(xué)院17級博士生孫瑞瑞、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心卓越學(xué)者鄧譜涓, 醫(yī)學(xué)院CLS項目17級博士生楊宇卓、王文娟高級工程師參與了本項目研究。本工作獲得了北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心、北京市生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心及國家自然科學(xué)基金委的經(jīng)費支持。

來源：北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心